流式细胞术（Flow cytometry，FCM）是一种对处在快速流动中的细胞或其它生物微粒逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术，具有特异性强、灵敏度高及速度快的特征。它集计算机技术、激光技术、流体力学、荧光标记技术、单克隆抗体技术、细胞免疫学于一体，按照细胞或生物颗粒的物理或化学性质，同时具有分析和分选细胞或生物颗粒的功能。

一、流式细胞仪的基本结构

流式细胞仪主要是由液流系统、光学系统、电子系统构成（部分机型还包含细胞分选系统）。液流系统是让细胞能够单列排列依次通过光信号检测点，是光路系统发挥作用的基础；光学系统始于激光器发射器，发射不同波长激光照射到细胞后，产生的光信号（散射光信号和荧光信号）会经过不同光学滤片传输到不同通道探测器；电子系统负责将接收到的光学信号转化为电子信号并进行分析，从混合细胞群中鉴别出不同的亚群；而具有分选功能的流式细胞仪则还能从大量细胞中分选出感兴趣的亚群进行更多研究。

1、散射光信号

FSC：前向角散射光信号表示细胞的大小；

SSC：侧向角散射光信号表示细胞内部颗粒的复杂度；

FSC

SSC

散射光信号由细胞（颗粒）本身及其内容物对激光的折射产生，主要反映了细胞（颗粒）的物理特征如大小或内部复杂程度。通过 FSC 和 SSC，可以将不同大小、不同颗粒复杂度的细胞群分开。

2、荧光信号

荧光信号：自发荧光、转染、荧光标记。

细胞自身荧光或使用特异性荧光染料、抗体标记细胞，对细胞的生物/化学指标进行检测。 

二、流式结果图片

1、直方图

X 轴代表一个通道的值，反映荧光信号或散射光信号相对强度，通常为对数，也可以为线性。Y 轴一般是细胞数。

2、散点图

X 和 Y 轴分别代表一个通道的值，反映荧光信号或散射光信号相对强度。通过两个参数可以将细胞亚群分开。

3、等高线图

借助地理的等高线图表示细胞的密集程度，环线代表密度相同的区域，环线中央代表细胞聚集的中心。

三、相关参数调节

1、阈值/触发信号（Threshold / Triger）

数据采集的前提条件所选择的信号被称为阈值或触发信号；阈值可以量化，大于该阈值的细胞信号才会被收集，以排除不必要杂质的干扰。

2、电压&增益

目的：调节检测器的信号扩增程度，信号随着电压或增益的增加而增强。

作用：通过电压及增益的调节区分信号强弱不同的细胞。

3、荧光补偿

每种荧光素分子都有自身光谱的发射范围，这些光谱之间存在叠加，如 Alexa Fluor 499 发射荧光由 530nm 滤片选择后检测，而 PE 发射荧光由 585nm 滤片选择后检测，此时有部分 FL1 的荧光出现在 PE 检测器中。

受激光照射后 Alexa Fluor 488 和 PE 分子发射光谱相互重叠

Cytoflex 流式细胞仪荧光补偿调节方法—横平竖直。

对于两色以上实验，通过设置单染管来调节补偿，以消除不同荧光素光谱因重叠所导致的假阳性误差。

4、圈门/设门（Gate）

设门是指在细胞分布图中指定某一个范围或某一细胞性状的细胞群，并对其进行单参数或多参数分析，根据某一细胞性状设门进行组合。

四、流式样品处理流程与注意事项

1、单细胞悬液制备：组织

组织在缓冲液中剪碎后直接在 300 目筛网上面研磨过筛。

2、单细胞悬液制备：血样

样本浓度要求：建议 105~106/ml；

样本要求：EDTA、肝素钠、柠檬酸钠抗凝全血（凝血、溶血样本应当弃用）；

样本类型：

（1）白细胞样本：需裂解去除红细胞；裂解液的选择：甲酸作用强，适用于一般检测；氯化铵作用温和，适用于低含量细胞（注意：温度过低会影响裂解效果）

（2）红细胞样本：PBS 或生理盐水稀释 1000倍；

（3）血小板样本：使用柠檬酸钠作为抗凝剂，通过 PBS 或生理盐水对血小板样品稀释。

3、单细胞悬液制备：细菌或酵母

处理方式：用生理盐水或缓冲液如 PBS 清洗 2-3 次，染色之前测定单位体积细胞数量，并根据实验调整细胞浓度至 106~107/ml。

注意：流式检测的是单细胞悬液，避免出现大颗粒性，或抱团细胞！上机前必须过滤！任何流式实验，不是细胞越多越好，应该在参考的范围内合理上样！

五、流式典型应用举例

1、细胞凋亡（自主有序的死亡）检测

正常情况下磷脂酰丝氨酸位于细胞膜的胞浆侧，细胞凋亡中期磷脂酰丝氨酸外翻至外侧与 Annexin V（Ca2+ 依赖的对 PS 具有高度亲和力的磷脂结合蛋白）结合，用荧光标记的 Annexin V 检测 PS 是否出现外翻来检测细胞凋亡情况。

在凋亡末期，由于细胞膜结构受损，核酸染料（如 PI、7-AAD 等）进入细胞而产生信号。分别检测 Annexin V （凋亡中期）和不透膜核酸染料（凋亡末期）的信号，可对凋亡中期和末期细胞的比例进行定量。

2、细胞周期检测

G0 期--相对静止，细胞不参与增殖，为二倍体 DNA。

间期：DNA 合成前期（G1 期）--合成 RNA 和核糖体，做能量准备；DNA 合成期（S 期）--合成 DNA（四倍体）和组蛋白；DNA 合成后期（G2 期）--合成 RNA 和蛋白质。

分裂期（M 期）

检测细胞周期常用的方法时检测 DNA 含量，应用细胞核 DNA 含量随细胞增殖周期时相变化的特点，用 DNA 染料进行染色，判断细胞所处的细胞周期时相和比例。

3、T 细胞免疫分型（Th（辅助性 T 细胞）/Treg（调节性T细胞））

通过刺激阻断剂对 T 细胞进行处理，通过检测表面或胞内标志物进行分型检测。

4、细胞免疫分型检测

利用细胞表面或细胞内特异性抗体分子，分别选用不同标记的流式抗体对细胞进行分型和分析；利用抗原/抗体反应原理，采用不同的流式抗体对样本进行检测可达到对不同细胞进行分型检测的目的。

5、细胞因子检测

采用 CBA 或液相芯片的方法将捕获抗体和微球/液相芯片结合，检测抗体和 SA-PE 结合通过抗原抗体特异性反应达到多种细胞因子检测的目的。

6、细胞分选

细胞分选利用流式细胞分选仪来分离纯化细胞或颗粒以供进一步分析。

7、其他

包括死/活细胞检测、线粒体检测、外泌体检测等。